TFF filtracija tangencijalnog protoka u kombinaciji s ultracentrifugiranjem za učinkovitu pripremu malih izvanstaničnih vezikula

Mali izvanstanični mjehurići (sEV) su nanorazmjerni mjehurići koje izlučuju stanice koje sadrže nukleinske kiseline, proteine, male molekule i druge komponente, a igraju važnu ulogu u međustaničnoj komunikaciji. Male izvanstanične vezikule-tipa egzosoma imaju velike sličnosti sa svojim roditeljskim stanicama. U usporedbi s umjetnim nanočesticama, one pokazuju niže stope imunološkog čišćenja i nižu citotoksičnost, što ih čini obećavajućim kandidatima kao novimin vivo vozila za dostavu lijekova. Gotovo sve vrste stanica mogu izlučivati ​​ove vezikule, a istraživanja o njihovoj primjeni kao prijenosnika lijekova postupno se pomiču iz laboratorija prema kliničkim primjenama. Međutim,velika{0}}proizvodnja ostaje glavno usko grlo.

 

Suvremene metode za izolaciju izvanstaničnih vezikula

Trenutačne metode izolacije izvanstaničnih vezikula uključujuultracentrifugiranje, centrifugiranje s gradijentom gustoće, kromatografija-ekskluzije (SEC) i taloženje polietilen glikola (PEG).

PEG taloženje nudi visok prinos i jednostavan rad, ali je povezano sa značajnom kontaminacijom neželjenim proteinima. Centrifugiranje s gradijentom gustoće i kromatografija za-isključivanje veličine mogu dati proizvode visoke-čistoće, ali njihova je učinkovitost relativno niska, a procesi zahtijevaju-vrijeme. Ultracentrifugiranje se naširoko koristi, ali njegov je volumen obrade ograničen kapacitetom centrifuge, što otežava povećanje.

 

Primjena filtracije tangencijalnog protoka za separaciju sEV

Filtracija tangencijalnog protoka (TFF) već je primijenjena za odvajanje nanočestica kao što su liposomi i lentivirusni vektori. U TFF-u, hrana teče tangencijalno preko površine membrane, što pomaže u smanjenju onečišćenja membrane i olakšava proces povećanja.

Budući da male izvanstanične vezikule uglavnom variraju od30–200 nmu promjeru, a0,45 μm membranska kasetamože se odabrati u TFF sustavu za uklanjanje većih proteina i vezikula, dok aMembranska kazeta od 300 kDamože se koristiti za uklanjanje proteina male molekularne-težine i koncentriranje malih izvanstaničnih vezikula prisutnih u mediju kulture.

 

Karakterizacija sirovine nakon odvajanja TFF

Analiza praćenja nanočestica (NTA) pokazala je da su promjeri čestica uglavnom raspoređeni unutar raspona0–250 nm.

 

 

Međutim, transmisijska elektronska mikroskopija (TEM) otkrila je veliku količinu kontaminirajućeg proteina, dok nisu uočene izvanstanične vezikule. Ovi rezultati pokazuju da je potreban dodatni nizvodni korak pročišćavanja za daljnje pročišćavanje izvanstaničnih vezikula.

 

Karakterizacija TFF koncentrata nakon 100 kDa ultrafiltracije

TFF koncentrat je dalje obrađen pomoću a100 kDa ultrafiltracijska cijev.

NTA je pokazala da su promjeri čestica u koncentratima dobivenim nakon jedne i dvije runde ultrafiltracije ostali uglavnom unutar raspona0–250 nm. Međutim, provođenje ultrafiltracije dvaput rezultiralo je značajnim smanjenjem broja dobivenih čestica.

TEM analiza pokazala je da strukture poput vezikula-nisu primijećene niti u jednokratnim-ni dvo-koncentratima ultrafiltracije, dok je ostala znatna količina kontaminirajućeg proteina.

Stoga,Ultrafiltracija od 100 kDa nije se mogla učinkovito koristiti za pročišćavanje medija kulture nakon koncentracije TFF.

 

 

Karakterizacija TFF koncentrata pročišćenog ultracentrifugiranjem

NTA je pokazala da su promjeri čestica pročišćenih proizvoda uglavnom raspoređeni unutar raspona od0–250 nm.

Važno je da je TEM jasno otkrio strukture poput vezikula-u različitim vidnim poljima. Ovi rezultati su pokazali da nakon koncentriranja medija kulture pomoću TFF,ultracentrifugiranje se može naknadno koristiti za daljnje odvajanje i pročišćavanje izvanstaničnih vezikula.

 

 

Karakterizacija sEV-ova izoliranih iz medija kondicioniranog mezenhimskim matičnim stanicama korištenjem TFF-a u kombinaciji s ultracentrifugiranjem

NTA je pokazala da su promjeri čestica pročišćenih proizvoda uglavnom raspoređeni unutar raspona od0–250 nm.

TEM-om su promatrane strukture poput vezikula-. Western blot analiza pokazala je pozitivnu ekspresiju proteina-povezanih s izvanstaničnim vezikulamaCD9, CD63 i ALIXu pročišćenim izvanstaničnim vezikulama.

Ovi rezultati potvrdili su da pročišćene male izvanstanične vezikule sadrže egzosome, što ukazuje da se ova metoda također može koristiti zaizolacija i ekstrakcija egzosoma.

 

 

Zaključak: TFF u kombinaciji s ultracentrifugiranjem za visoko{0}}kvalitetnu pripremu sEV

Studija je to pokazalaSama koncentracija TFFrezultiralo je proizvodom koji je sadržavao značajnu količinu kontaminirajućih proteina i stoga je bio nedovoljan za dobivanje kvalificiranih izvanstaničnih vezikula.

Isto tako, koristeći a100 kDa ultrafiltracijska cijev za sekundarno pročišćavanjenije učinkovito dao netaknute strukture vezikula.

Kombiniranjem koncentracije TFF s naknadnim pročišćavanjem ultracentrifugiranjem, prednosti obiju tehnika mogu se integrirati kako bi se dobilovisoko{0}}kvalitetni proizvodi malih izvanstaničnih vezikula.

U usporedbi samo s konvencionalnim ultracentrifugiranjem, kombinirani postupak može učinkovitosmanjiti ukupno vrijeme obrade i poboljšati učinkovitost odvajanja.

U ovom tijeku rada,TFF omogućuje brzo obogaćivanje velikih{0}}uzoraka, baveći se ograničenjima konvencionalnog ultracentrifugiranja u obradi velikih volumena uzoraka. Ultracentrifugiranje zatim izvodi dubinsko pročišćavanje kako bi se uklonile ko-koncentrirane proteinske nečistoće dok pomaže u održavanju čistoće i cjelovitosti vezikula.

Nadalje, postupak ne zahtijeva dodavanjeegzogeni kemijski taložni reagensi, pomažući očuvanju biološke aktivnosti vezikula u najvećoj mogućoj mjeri.

Iz perspektive industrijskog prevođenja, ovaj proces je značajanpovećati-potencijali može pomoći u rješavanju izazova povezanih s-velikom proizvodnjom izvanstaničnih vezikula zaisporuka lijekova, regenerativna medicina i povezani razvoj proizvoda. Također pruža čvrstu eksperimentalnu osnovu za kasniju optimizaciju procesa i pilot{1}}proizvodnju.

 

Referenca

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha, et al.Uspostavljanje metode za odvajanje malih izvanstaničnih vezikula tangencijalnom filtracijom u kombinaciji s ultracentrifugiranjem. Kineski biološki časopis, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.