Eksperimentalne primjene i rješenja za rješavanje problema za ultrafiltracijske centrifugalne cijevi

Ultrafiltracijska centrifugalna cijev često je korišten uređaj za membransku filtraciju u laboratoriju. Njegova temeljna komponenta je ultrafiltracijska membrana s ograničenjem specifične molekularne težine. Uobičajeni materijali membrane za ultrafiltraciju uključuju polietersulfon (PES) i regeneriranu celulozu (RC). Načelo rada ultrafiltracijske centrifugalne cijevi je korištenje centrifugalne sile i prosijavanja na temelju molekularne -veličine-za provođenje malih molekula kroz ultrafiltracijsku membranu, čime se omogućuje brzo koncentriranje, odsoljavanje, izmjena pufera ili pročišćavanje i odvajanje biomakromolekula kao što su proteini i nukleinske kiseline.

 

MWCO odabir

Protein	Preporučeni MWCO	Preporučeno vrijeme centrifugiranja
6-20 kDa	3 kDa	40 min
20-30 kDa	5 kDa	30 min
30-60 kDa	10 kDa	20 min
60-100 kDa	30 kDa	20 min
100-200 kDa	50 kDa	15 min
200-600 kDa	100 kDa	15 min
>600 kDa	300 kDa	15 min
Jednolančane- ili dvolančane-molekule nukleinske kiseline	Preporučeni MWCO	Preporučeno vrijeme centrifugiranja
137-1159 bp	30 kDa / 100 kDa	10 min (rotor s fiksnim-kutom, 5000 × g)
Nanozrnca	Preporučeni MWCO	Preporučeno vrijeme centrifugiranja
1,5–2 nm	3 kDa	40 min
2–3 nm	5 kDa	30 min
3–5 nm	10 kDa	20 min
5–7 nm	30 kDa	20 min
7-10 nm	50 kDa	15 min
10-30 nm	100 kDa	15 min
>30 nm	300 kDa	15 min

 

Za proteine ​​se preporuča odabrati membranski MWCO koji je 2-6 puta niži od molekularne težine ciljanog proteina. Ako se također uzme u obzir brzina protoka, preporučuje se membranski MWCO ispod ovog raspona 2×–6×.

 

Slučaj primjene (DNK iz izdvojenih stanica)

Za konvencionalnu metodu, komad gaze veličine 2,5 cm × 2 cm je izrezan, liziran u sustavu malog-volumena i izravno pročišćen pomoću instrumenta. Za metodu koncentracije, područje uzorkovanja gaze je udvostručeno. Nakon lize, digestivni supernatant je prebačen u 100 kDa ultrafiltracijsku centrifugalnu epruvetu, koncentriran centrifugiranjem na 10.000 o/min, oporavljen invertiranim centrifugiranjem, i zatim podvrgnut ekstrakciji DNA korištenjem potpuno automatiziranog instrumenta za pročišćavanje nukleinske kiseline. Volumen eluacije bio je ravnomjerno postavljen na 40 μL kako bi se osiguralo da su početne razine stanica u dvije skupine bile u biti usporedive.

 

Kvantitativno testiranje pokazalo je da je prosječna koncentracija DNA bila 0,099 ± 0,041 ng/μL za konvencionalnu metodu i 0,193 ± 0,068 ng/μL za metodu koncentracije. Razlika između dvije skupine bila je statistički značajna (P < 0,01). Ukupni prinos DNA dobiven metodom koncentracije bio je 1,95 puta veći od konvencionalne metode, pokazujući da korak koncentracije ultrafiltracije nije uzrokovao gotovo nikakav gubitak ukupne DNA. Vrijednosti Ct dviju skupina bile su 27,64 ± 0,39 odnosno 27,58 ± 0,40, s P > 0,01, što ukazuje da tretman ultrafiltracijom nije uveo inhibitore PCR amplifikacije niti ometao naknadne reakcije amplifikacije.

 

Za STR genotipizaciju, potpuni genotip definiran je potpunim trakama na svakom lokusu i srednjom visinom vrha većom ili jednakom 200 RFU. Među 20 paralelnih uzoraka, konvencionalna metoda je dala potpune genotipove za samo 14 uzoraka, dok je metoda koncentracije postigla potpunu STR genotipizaciju za svih 20 uzoraka, značajno poboljšavajući učinkovitu stopu otkrivanja genotipizacije uzoraka u tragovima kontakta.

Ultrafiltracijske centrifugalne cijevi Guidling Technology imaju jednostavan rad, visoke faktore koncentracije i visoke stope oporavka uzorka, a naširoko se koriste u biokemiji, molekularnoj biologiji i drugim područjima. Stopa oporavka ultrafiltracijskih centrifugalnih cijevi Guidling Technology varira ovisno o materijalu koji se obrađuje i općenito može premašiti 90%.

 

Uobičajeno rješavanje problema

Problem	Mogući uzrok	Otopina
Tijekom koncentracije dolazi do taloženja	Koncentracija je prebrza	Smanjite brzinu centrifugiranja
		Upotrijebite cijev za ultrafiltraciju s višom graničnom mjerom molekulske mase
		Pipetirajte gore-dolje u centrifugalnoj epruveti, zatim ponovno centrifugirajte
	Preko-koncentracija	Preporuča se da konačna koncentracija proteina nakon koncentracije ne prelazi 20 mg/mL
Voda se ne može filtrirati	Ultrafiltracijska membrana je potpuno suha, a površina membrane postaje slabo hidrofobna	Navlažite membranu otapalom s-površinskom-napetošću (npr. izvedite početno centrifugiranje s 20% etanola u vodi)
U koncentratu nema ciljanog proteina	Početna koncentracija uzorka proteina je preniska (< 25 μg/mL)	Ako je koncentracija uzorka niska, a volumen velik, više puta stavite uzorak i centrifugirajte
	Neispravan odabir MWCO membrane	Membranski MWCO je općenito manji od 2 puta molekularne težine ciljnog proteina ili veći
	Centrifugalna sila je izvan navedenog raspona	Preporučena centrifugalna sila: 3000–5000 × g
	Ciljani protein se istaložio	Podesite ciljnu koncentraciju proteina u koncentratu (prilagodite faktor koncentracije)
		Kontrolirajte temperaturu i pH
		Koristite aditive
		Podesite ionsku snagu
Do smetnji dolazi tijekom nizvodne analize koncentriranog proteina	Membrana za ultrafiltraciju sadrži glicerol u tragovima	Prethodno-isperite epruvetu za ultrafiltraciju puferom i pročišćenom vodom. Ako smetnje potraju, očistite s 0,1 M NaOH, zatim isperite pročišćenom vodom i osušite centrifugom
Kontaminacija RNazom	Ne jamči se da je epruveta za ultrafiltraciju bez RNaze-	Preporuča se namakanje u 0,1% DEPC na 37 stupnjeva tijekom 2 sata kako bi se potpuno deaktivirala RNaza; zaostali DEPC može se ukloniti ispiranjem pročišćenom vodom
Kontaminacija endotoksinom	Isporučene ultrafiltracijske cijevi nisu bile podvrgnute tretmanu-uklanjanja endotoksina, a endotoksini su naširoko prisutni u prirodi	Prije eksperimenta, prethodno -očistite s 0,5 M NaOH, nakon čega slijedi ispiranje pročišćenom vodom kako biste uklonili većinu endotoksina