Ultrafiltracija šupljih vlakana od 300 kd: Analiza visoko-učinkovitog procesa koncentracije i pročišćavanja za O/A virus-i-usne bolesti
Sep 03, 2026| Uvod
Slinavka i šap (FMD) je akutna, febrilna i vrlo zarazna bolest životinja uzrokovana virusom slinavke i šapa (FMDV). Ovaj virus pogađa papkare, s više od 70 osjetljivih vrsta. Brzo se širi i ima visoku stopu morbiditeta, obično zahvaća glavne vrste stoke poput svinja, ovaca i goveda, gdje incidencija može doseći 100%. FMDV pripada roduVirus stopala-i-ustaiz obitelji MicroRNAviridae. Čestice su sferične, približno 27-30 nm u promjeru, sa sedimentacijskim koeficijentom od 146S za intaktne virusne čestice. Trenutno su dostupna različita cjepiva protiv šapa i šapa, uključujući atenuirana živa virusna cjepiva, živa virusna vektorska cjepiva, inaktivirana cjepiva, cjepiva nukleinske kiseline, sintetička peptidna cjepiva i podjedinična cjepiva. Inaktivirana cjepiva protiv šapa i šapa općenito imaju manje nuspojava kod životinja, a viševalentna cjepiva nude bolju učinkovitost imunizacije, što ih čini glavnim osloncem prevencije šapa i šapa u Kini.
Ultrafiltracija tangencijalnog protoka
Trenutačno je ultrafiltracija tangencijalnog protoka često korištena metoda pročišćavanja i koncentriranja u -proizvodnji multivalentnih inaktiviranih cjepiva protiv slinavke i-usta. Ova metoda ne samo da postiže željeni faktor koncentracije, već također uklanja veliku količinu stranih nečistoća. Tangencijalna ultrafiltracija uglavnom se koristi za pročišćavanje, koncentraciju i filtraciju (odsoljavanje i zamjena pufera). Osim toga, također se može koristiti za bistrenje fermentacijske juhe ili medija za stanične kulture korištenjem tangencijalne mikrofiltracije protoka, čime se zamjenjuje centrifugiranje ili primarno bistrenje.
U konvencionalnoj vertikalnoj filtraciji, velike molekule imaju tendenciju nakupljanja na površini membrane, začepljujući filtar. Filtracija tangencijalnog protoka, međutim, omogućuje da protok teče paralelno s membranom, izbjegavajući ovaj problem začepljenja. Tijekom tangencijalne filtracije protokom, otapalo i tvari manje od veličine pora membrane koje prodiru kroz membranu nazivaju se permeatom, dok se tvari veće od veličine pora zadržavaju kao koncentrat. U kombinaciji s optimiziranim procesima pranja i filtracije, može se postići odvajanje i pročišćavanje molekula različitih veličina. Ova tehnologija nudi prednosti kao što su niska cijena, blagi radni uvjeti, praktično čišćenje i zamjena, visoka brzina protoka membranskog permeata i jednostavno rukovanje, što je čini posebno prikladnom za koncentraciju i pročišćavanje bioaktivnih tvari u velikim-razmjerima.
Materijali i metode
Kolona šupljih vlakana:Granica molekularne težine od 300 kd, površina membrane od 1600 cm².
Materijali:5,6 L svakog supernatanta iz FMDV tipa O i tipa A nakon centrifugiranja i bistrenja.
Parametri procesa:Tijekom ultrafiltracijske koncentracije, sila smicanja je podešena na približno 3000⁻¹, a TMP je kontroliran da ne bude veći od 10 psi. Kada se faktor koncentracije približio 11 puta, uzorak je ispran s 6CV otopinom pufera. Nakon pranja, sterilni zrak je uveden u ulaznu cijev, a sav koncentrirani uzorak u cijevi je ubrizgan u bocu za koncentraciju uzorka. Zatim je dodan sterilni PBS za ispiranje cijevi dok konačni volumen koncentrirane tekućine nije bio 500 mL, čime se poboljšava ukupna stopa oporavka.
Rezultati i rasprava
U smislu početnog pročišćavanja virusa, ultrafiltracijska koncentracija postiže stopu uklanjanja od preko 90% za nečistoće kao što su proteini koji ne sadrže viruse. Što se tiče volumena, može postići visoke koncentracije od 10-50 puta, pružajući snažnu podršku za naknadno pročišćavanje. Odabrana je kolona sa šupljim vlaknima s graničnom vrijednosti molekulske težine od 300 kd. Ova veličina pora, dok zadržava više od 85% virusa, može ukloniti više od 90% nečistoća proteina. Površina membrane je 1600 cm², a protok je 2-5 mL/cm², što omogućuje da se ultrafiltracijska koncentracija završi unutar učinkovitog vremena (unutar 2 sata). Detaljna koncentracija ultrafiltracije i podaci o pročišćavanju prikazani su u tablici 1.
Tablica 1. Rezultati ukupne detekcije antigena slinavke i-usta (tipovi O i A)
| Naziv uzorka | Tekuća hrana | Volumen (mL) | Sadržaj 146S (ug/mL) | Stopa oporavka 146S (%) | Koncentracija proteina (ug/mL) | Stopa uklanjanja proteina (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| O-vrsta | Izvorno rješenje | 5600 | 2.53 | 87.94 | 5040 | 94.38 |
| O-vrsta | Koncentrat | 500 | 24.92 | 87.94 | 3170 | 94.38 |
| A-vrsta | Izvorno rješenje | 5600 | 3.37 | 94.80 | 5980 | 93.55 |
| A-vrsta | Koncentrat | 500 | 35.78 | 94.80 | 4318 | 93.55 |
Razmatranja metode pročišćavanja
Trenutačno postoje različite metode pročišćavanja, ali čak i s istom metodom za isti antigen, učinak pročišćavanja je često nezadovoljavajući iz mnogo razloga, uključujući karakterizaciju antigena i procesne parametre. Na primjer, promjene u prethodnom molekularnom dizajnu ili sustavima kulture fermentacije mogu promijeniti molekularnu strukturu virusa, što dovodi do nezadovoljavajućih rezultata pročišćavanja. Neprikladne metode bistrenja mogu povećati troškove sirovina ili količinu heterolognih proteina, povećavajući pritisak na daljnje pročišćavanje. Neodgovarajuća koncentracija ultrafiltracije, kao što su različite veličine pora membrane ultrafiltracije, faktori koncentracije i eluacije, ulazne brzine protoka, brzine filtracije i TMP, mogu rezultirati niskim stopama oporavka antigena. Opsežna praksa pokazuje da loše pročišćavanje može uzrokovati značajne nuspojave kod životinja nakon imunizacije, što može dovesti do smrti.
Zaključak:Ova studija pokazuje da se, u procesima tangencijalnog protoka, odabirom odgovarajuće veličine pora membrane (300 kd), omjera pranja, brzine ulaznog protoka i TMP-a, može osigurati i visoka stopa povrata i maksimalno uklanjanje nečistoća.